LAPORAN ACARA ISOLASI DNA PLASMID

BAB 1  PENDAHULUAN

1.1              Latar Belakang

 Seiring dengan perkembangan waktu perkembangan semakin meingkat, sehingga dalam hal ini dapat menimbulkan beberapa permasalahan yang cukup serius seperti perebutan  tempat dan pangan. Perkembangan waktu ini pula mampu mendorong  peradapan dunia dengan teknologi yang semakin berkembang sangat pesat. Segala macam teknologi dapat tercipta  dengan sangat mudah, memberikan pengaruh yang sangat besar untuk perubahan dunia. Salah satu teknologi yang sangat berkembang sangat pesat saat ini, ialah  Bioteknologi yang memanfaatkan bahan –bahan molekuler yang tak dapat dilihat dengan mata telanjang, namun mampu meberikan perubahan yang sangat luar biasa untuk  kehidupan manusia.

Rekayasa genetika merupakan dari bidang bioteknologi yang juga merupakan  salah satu ilmu terapan dalam  rekayasa  genetik  yang sangat bermanfaat dalam kehidupan manusia.  Rekayasa genetika ini memiliki obyek yang sangat luas  dan mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan  tingkat rendah, fungi , hewan tingkat  rendah, tingakt tinggi  hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan  seperti bidang kedokteran, farmasi, Ilmu pangan hingga bidang-bidang pertanian  serta peternakan . Rekayasa genetika ini  memiliki manfaat serta peran yang sangat penting dalam kehidupan seperti pembuatan produk-produk bioteknologi .

             Dalam kegiatan rekayasa genetika isolasi plasmid DNA merupakan salah satu hal yang sangat penting, sebelum bakteri disisipi oleh plasmid  rekombinan yang telah tersisipi oleh gen maka perlu disisipkan terlebih dahulu plasmid sebagai vektor, baik sebagai cloning vektor  untuk tujuan perbanyakan  copy dari goi maupun  sebagai expression vektor untuk tujuan ekspresi goi pada sel host.

             Plasmid sendiri memiliki pengertian  sebagai molekul DNA srikuler berukuran relatif kjecil dari luar kromosom  yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat didalam plasmid  pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu  bakteri, tetapi sering kali menjadi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam kegiatan rekayasa gentika DNA plasmid seringkali digunakan sebagai  vektor  untuk membawa gen-gen  tertentu yang dinginan  ke dalam  suatu sel inang. Gen-gen tersebut  selanjutnya akan mengekspresikan produk-produk komersil tertentu  seperti inuslin , interferon dan berbagai enzim

             Keberhasilan dalam mempersiapkan plasmid  dengan kualitas yang baik sangat diperlukan, terlebih lagi tingkat kemurnian plasmid apabila akan digunakan untuk squencing PCR, cloning dan restriction digestion. Oleh karena itu dalam kegiatan pratkum ini sangat pentig sekali untuk dilakukan, karena dengan melakukan kegiatn praktikum secara langsung mahasimwa atau praktikan dapat mengertahui secara langsung  dan memiliki pengalaman serta  keahlian dalam menerapkan ilmu  serta mahasiswa dapat memahami dasar ilmu isolasi DNA plasmid secara  lebih rinci.

1.2              Tujuan          
            Mengetahui cara isolasi DNA dari Plasmid

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Setiap sel bakteri memperoleh suatu plasmid rekombinan yang membawa fragmen DNA asing yang spesifik, dimana pada percobaan pertama dilakukan oleh Herbert boyer dan Stanley kohen pada tahun 1973 yang dipotong dengan EcoR1. Plasmid rekombinan dengan gen tahan sebagai vektor bagi DNA telah banyak digunakan dalam bidang kesehatan. Penggunaan palasmid-plasmid yang membawa gen resisten terhadap antibiotik yang telah tersebar luas di alam dengan memutasikan plasmid-plasmid tersebut sehingga tidak begerak dari suatu sel ke sel yang lain dan dengan menggunakan strein bakteri yang aman sehingga penggunaan plasmid yang resisten terhadap obat-obatan dapat digunakan tanpa risikko (Watson et al, 1983).

Isolasi DNA dari gel dilakukan dengan menggunakan ekstraksi phenol, dimana kemurnian RNA dihitung melalui perbandingan nilai absorbansi sampel RNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kualitas total RNA diuji dengan cara mengelektroforesis pada 1 % gel agarose. Isolasi RNA dengan menggunakan buffer homogenisasi guanidium tiosianat merupakan metode yang efisien untuk jaringan yang tidak mudah di faksinasi dari gel yang kaya akan Rnase. Hasil beberapa penelitian diperoleh bahwa isolasi RNA dengan metode phenol tidak dadat terdeteksi dalam elektroforesis gel agarose. Pada penelitian Slameto dan Sugiharato (2010) pada tanaman tebu dilakukan isolasi dengan cara memmotong DNA dengna enzim restriksi dalam analisis DNA rekombinan. Plasmid DNA yang mengandung DNA target dipotong beberapa menggunakan enzim restriksi. Kontaminasi Oleh DNA dihilangkan dengan melakukan pemberian Dnase sehingga dapat meningkatkan kemurnian RNA dan mampu mendetanurasi DNA genomik.

Plasmid merupakan DNA Ekstrakorosomal kecil yang berbentuk sirkuler, yang dapat melakukan replikasi secara mandiri sehingga tidak bergantung pada replikasi DNA Kromosom. Molekul  DNA yang dimiliki oleh plasmid adalah molekul DNA double stranded yang memiliki panjang basa yang sangat beragam. Plasmid dimiliki oleh bakteri dan beberapa jenis makhluk hidup eukariotik. Proses isolasi DNA memiliki perbedaan tergantung pada organisme yang akan diisolasi DNA nya. Isolasi DNA digunakan untuk memisahkan DNA sehingga DNA dapat dianalisis. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu replication origin, marker yang memungkinkan  adanya  seleksi  dan  region  yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar. Menurut Sumarsih dkk, (2011) Pemotongan ganda DNA plasmid rekombinan (E1) menggunakan enzim restriksi SacI/ SphI menghasilkan dua fragmen DNA, yang ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA pada elektroforegram dengan ukuran sekitar 7000 pb dan sekitar 1500 pb.

Plasmid yang melingkar pada kromosom ekstra molekul sitoplasma ganda yang meniru secara independen dari kromosom bakteri. Secara alami plasmid terjadi pada bakteri dan kadang-kadang ditemukan pada organisme eukariotik. Metode tradisional isolasi plasmid adalah menggunakan metode lisis alkali dan metode mendidih. Proses ekstraksi didasarkan pada ukuran, konformasi dan kepadatan plasmid. semua ekstraksi proses bervariasi adalah lisis sel bakteri, rilis selektif DNA plasmid dari matriks sel, dan penghapusan kontaminan seperti untuk memulihkan DNA plasmid. Masalah dalam praktek umum yang sering dikaitkan dengan isolasi plasmid DNA murni adalah masalah adanya kontaminan oleh senyawa fenolik dan polisakarida karena mereka menghambat primer klasik PCR dengan menghambat aktivitas polimerase Taq DNA. Kontaminasi ini mendistorsi hasil di banyak aplikasi analisis dan karena itu menyebabkan interpretasi yang salah. Konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan cara mengambil absorbansi 620 nm yang dievaluasi melalui larutan gel agarose 1% (Yadav et al, 2011).

            Genomik, plasmid dan pemurnian produk PCR didasarkan pada pemurnian silika. Terlepas dari metode yang digunakan untuk membuat lisat dibersihkan, DNA dapat diisolasi berdasarkan kemampuannya untuk mengikat silika dengan adanya konsentrasi garam yang tinggi. Garam-garam ini kemudian dihapus dengan mencuci berbasis alkohol dan DNA dielusi dalam larutan rendah ion-kekuatan seperti TE penyangga atau air. Pengikatan DNA untuk silika tampaknya didorong oleh dehidrasi dan ikatan hidrogen formasi, yang bersaing dengan lemah tolakan elektrostatis. Oleh karena itu, konsentrasi garam yang tinggi akan membantu mendorong adsorpsi DNA ke silika, dan konsentrasi rendah akan melepaskan DNA. Namun, DNA bukan satu-satunya molekul yang dapat menyerap sinar UV pada 260 nm. Sejak RNA juga memiliki absorbansi yang besar pada 260 nm, dan asam amino aromatik hadir dalam protein menyerap pada 280 nm (Kheyrodin dan Ghasvinian, 2012).

            Isolasi total DNA menggunakan DNA NucleoSpin Tissue Kit yang merupakan kit khusus untuk bakteri gram negatif dan hasil isolasi total DNA pada beberapa sampel tanaman wortel terlihat adanya lajur pita DNA pada elektroforesis gel agarosa 1%. Menurut Ausubel, et al dalam Manalu, 2014), gel agarosa 1% dapat digunakan untuk menganalisis fragmen DNA sebesar 500 pb-10.000 pb. Selanjutnya, menurut Manalu dkk, (2014) Kualitas dan kuantitas DNA yang bervariasi pada setiap sampel dapat dilihat dari panjang fragmen DNA atau tebal pita DNA yang dihasilkan. DNA hasil isolasi pada sumur ke 2 mempunyai ketebalan pita yang paling tebal, dan sumur ke 3 mempunyai ketebalan pita agak tebal. Hal ini menunjukkan bahwa pada sumur ke 2, hasil isolasi total DNA nya sangat banyak dan pekat. Sedangkan pada sumur ke 1 tidak terdapat pita-pita DNA, ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya. DNAyang larut akan hilang sehingga perendaman yang terlalu lama pada buffer TAE dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk jumlah pasang basa yang berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya.

BAB 3. METODE PRAKTIKUM

3.1    Waktu dan Tempat

Pratikum mata kuliah Bioteknologi Pertanian acara “Isolasi DNA plasmid Menggunakan KIT Gene All” dilaksanakan pada hari Senin tanggal 27 Oktober 2015 pukul 09.00- selesai di Fakultas Pertanian, Universitas Jember.

3.2    Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

1.        Perangkat Elektroforesis

2.        Microwave

3.        Micropipete

4.        Enlemeyer

3.2.2 Bahan

1.        Agarose gel 1 %

2.        TBE 1x

3.        Ethium bromide

4.        Buffer loading

3.3    Cara Kerja

1.        Mengambil 1,5 mL dari kultur bakteri, memasukkan dalam tube, sentrifuse dengan kecepatan 13.000 xg selama 1 menit. Membuang supernatant sehingga hanya tersisa pellet.

2.        Meresuspensi pellet dalam 170 ul buffer S1 (mengandung RNAse sehingga kondisikan selalu dingin).

3.        Menambahkan 170 ul buffer S2 dan mix dengan membalikkan tube 3-6 kali (jangan divortex). Menginkubasi hingga terlihat suspense bakteri tetapi tidak boleh lebih dari 5 menit.

4.        Menambahkan 250 ul buffer G3 kemudian segera mix dengan membalikkab tube 4-5 kali (jangan divortex).

5.        Memindahkan seluruh Lysate  dari tube ke kolom (yang disediakan oleh KIT isolasi DNA plasmid), kemudiana disentrifuse selama 30-60 detik. Mengambil kolom dan membuang cairan yang ada pada tube dibagian bawah kolom, kemudian meletakkan lagi kolom padatube tersebut.

6.        Optional, menambahkan 500 ul buffer A W dan sentrifus selama 30 detik. Mengangkat kolom, membuang cairan yang ada pada tube di bawah kolom, dan meletakkan kembali kolom pada tube tersebut.

7.        Menambahkan 700 ul buffer PW dan sentrifus selama 30 detik. Mengangkat kolom dan membuang cairan yang ada pada tube di bagian bawah kolom, kemudian meletakkan lagi kolom pada tube tersebut.

8.        Mensentrifus kembali selama 1 menit untuk membuang reside wash buffer. Memindahkan kolom ke 1,5 ml tube (epedorf tube).

9.        Menambahkan 50 ul buffer EB atau deionized distilled water ke tengah kolom, kemudian diamkan selama 1 menit dan sentrifus selama 1 menit.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.2 Pembahasan

Konsentrasi DNA dapat diketahui melalui analisis menggunakan spektrofotometer UV (Ultraviolet) dengan panjang gelombang 260 nm. Kemurnian DNA dari kontaminan RNA maupun protein dapat dilihat berdasarkan perbandingan absorbansi suspensi DNA. Adapun rumus untuk mengetahui konsentrasi DNA yaitu ,  nilai 300 tersebut diperoleh dari tingkat pengenceran yang dilakukan (1500 ml aquades : 5 . Berdasarkan hasil praktikum tentang isolasi DNA plasmid diperoleh nilai absorbansi sebesar -0,024 oleh kelompok 2, nilai absorbansi diperoleh dari sampel yang telah dianalisis menggunakan spektroforesis UV dengan panjang gelombang 260 nm. Jika diketahui nilai absorbansi sebesar -0,024, maka diperoleh konsentrasi DNA sebesar -0,36, dengan perhitungan sebagai berikut.

Rumus: Konsentrasi DNA = Absorbansi x 50 x 300

                                                                 1000

                                              = - 0, 024 x 50 x 300

                                                               1000

                                              = - 360

                                                  1000

                                              = - 0,36

Berdasarkan hasil tersebut dapat dibuktikan bahwa kemurnian DNA masih belum relatif murni dari kontaminan protein,  Manalu dkk (2014), berpendapat bahwa isolat DNA dapat dikatakan murni dari kontaminan bila nilainya berkisar antara 1,8-2,0. Adapun berdasarkan data golongan konsentrasi DNA tertinggi diperoleh oleh kelompok 3 dengan nilai absorbansi sebesar 0.045 maka dihasilkan konsentrasi DNA sebesar 0.675, sedangkan nilai terendah diperoleh oleh kelompok 9 dan 10 dengan niali absorbansi dan konsentrasi DNA sebesar 0. Rendahnya nilai konsentrasi DNA dapat dipengaruhi oleh besarnya suhu yang terlalu tinggi (99 ⁰C) saat proses pemecahan dinding sel (lisis), ketika melakukan ekstraksi tidak dilakukan penambahan buffer, dan penggunaan PBS yang berfungsi untuk mengisolasi DNA virus mengakibatkan jumlah isolat DNA yang sedikit sehingga konsentrasi yang diperoleh juga rendah. Perbedaan konsentrasi pada setiap kelompok (sampel) berbeda-beda hal ini disebabkan oleh perlakuan fisik yang diberikan serta kemampuan buffer ekstraksi dalam proses lisis (pemecahan dinding sel). Semakin tinggi ekstraksi lisis sehingga plasmid yang dihasilkan lebih banyak, diduga saat praktikum isolat DNA plasmid terjadi perbedaan dalam penambahan konsentrasi.

            Molekul DNA  dalam suatu sel dapat diektrasi atau diisolasi  untuk berbagai macam  keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dengan  dari bahan lain seperti  protein, lemak dan kabohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga  yakni penghancuran ( lisis) , ektrasi  atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulose protein, serta pemurnian DNA ( Dolphin, 2008 ).

Surzycki (2000) melaporkan  ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA , metodenya yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA , dan motedenya harus sederhana dan cepat. Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti KIT Nucleon Phytopure sedangkan untuk kegiatan isolasi yang dilakukan pada hewan menggunakan Gene JETTM Genomic DNA purifikation Kit. Namun tehapan –tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memilki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.

            Tahapan –tahapan pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan isolasi DNA  atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel merupakan  tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel  atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing –thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al.,2005) . Adapun tahapn yang selanjutnya ialah tahapan ektraksi DNA, yang seringkali digunakan Chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acit ( EDTA) yang memiliki peran untuk menginaktivasi enzim Dnase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease  dengan cara megikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim  DNAase . DNA yang telah diekstraksi  dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protin agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian  yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ektraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya  dna mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi.

            Setelah proses ekstraksi DNA yang didapat dipekatkan melalui pertisipasi, pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol  dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada  fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk  struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sntrifugasi . Presipitasi ini memiliki fungsi untuk menghilangkan  residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ektraksi. Adapun prinsip dari persipitasi ini ialah menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar menggelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfosiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur  dengan air, namun kurang polar dibandingkan dengan air. Pada tahapan ini DNA yang terpresitasi akan terpisah  dari residu-residu RNA dan protein  yang masih tersisa.    
            Adapun tingkat keberhasilan isolasi plasmit DNA sangat dapat dilihat dari tidak terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforesis, kecuali pada sumur kesatu yang merupakan lamda 10 ng/µl dan  sumur kedua yaitu kontrol positif Pgem T-easy yang terbentuk pita-pita DNA hasil isolasi pada sumur gel agarosa.  , Ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita  yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya (Sambrook & Russel 2001).

 

BAB 5. PENUTUP

5.1  Kesimpulan

            Berdasarkan hasil praktikum Isolasi Plasmid DNA yang dituangkan dalam pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa. Nilai absorbansi terbesar adalah pada kelompok 3 dengan nilai sebesar 0.045 dan konsentrasi DNA sebesar 0.675, sedangkan nilai terendah diperoleh oleh kelompok 9 dan 10 dengan niali absorbansi dan konsentrasi DNA sebesar 0.

5.2 Saran

            Untuk praktikum kali ini cukup berjalan dengan baik,hanya saja pengerjaan semua proses praktikumnya praktikan hanya dapat melihat saja. Untuk praktikum selanjutnya alangkah baiknya jika yang mengerjakan praktikan dipandu dengan asisten.

DAFTAR PUSTAKA

Dolphin.T 2004. Sejarah dan prinsip-prinsip media konduktif standar          elektroforesis DNA. Anal Biochem. 333 (1):1-13.

Kheyrodin, H., K, Ghazivian. 2012. DNA Purification And Isolation Of Genomic DNA From Bacterial Species By Plasmid Purification System. Agricultural Research, 7(3): 433-442.

Lodish H et al.Molekular Cell Biology Fifth Edition. New York : Garland Publishing, Inc

Manalu, Y, H., I, G, P, Wirawan, I, G, K, Susrama. 2014. Isolasi dan Identifikasi Agrobacterium tumefaciens dari Tanaman Wortel (Daucus carota L.). Agroteknologi tropika, 3(3): 119-127.

Sambrook & Russel 2001). 2001. Molecular and Cell Biology. New York: Mc Graw-Hill.

Slameto, B, Sugiharato. 2010. Isolasi cDNA Sucrose Transporter (SUT) dari Batang Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.). Agrovior, 3(2): 87-94.

Sumarsih, S., N,N, T, Puspaningsih, A, Soewandi. 2011. Rekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid Phis1525. Jbp, 13(3): 150-154.

Surzycki J, Russel DW . 2000 . Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd
            Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Watson, J.D. John, T. David. T, K. 1983. DNA Rekombinan, Suatu Pelajaran Singkat. Terjemahan oleh Dr. Ir. Wisnu Gunarso, M.Sc. 1988. Jakarta: Erlangga.

Yadav, P., A, Yadav, V, Garg, T,K, Datta, S, L, Gosmawi, S, De. 2011. A Novel Method Of Plasmid Isolation Using Laundry Detergent. Experimental biology, 1(49): 558-560.

Zhang, Y., J, Su, S, Duan, Y, Ao, J, Dai, P, Wang, Y, Li, B, Liu, D, Feng, J, Wang, H, Wanag. 2011. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant methods, 7(30): 1-14.