BAB
1 PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Seiring dengan perkembangan waktu perkembangan
semakin meingkat, sehingga dalam hal ini dapat menimbulkan beberapa permasalahan
yang cukup serius seperti perebutan
tempat dan pangan. Perkembangan waktu ini pula mampu mendorong peradapan dunia dengan teknologi yang semakin
berkembang sangat pesat. Segala macam teknologi dapat tercipta dengan sangat mudah, memberikan pengaruh yang
sangat besar untuk perubahan dunia. Salah satu teknologi yang sangat berkembang
sangat pesat saat ini, ialah
Bioteknologi yang memanfaatkan bahan –bahan molekuler yang tak dapat
dilihat dengan mata telanjang, namun mampu meberikan perubahan yang sangat luar
biasa untuk kehidupan manusia.
Rekayasa
genetika merupakan dari bidang bioteknologi yang juga merupakan salah satu ilmu terapan dalam rekayasa
genetik yang sangat bermanfaat
dalam kehidupan manusia. Rekayasa
genetika ini memiliki obyek yang sangat luas
dan mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi,
hewan tingkat rendah, fungi , hewan
tingkat rendah, tingakt tinggi hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika
sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan
seperti bidang kedokteran, farmasi, Ilmu pangan hingga bidang-bidang
pertanian serta peternakan . Rekayasa
genetika ini memiliki manfaat serta
peran yang sangat penting dalam kehidupan seperti pembuatan produk-produk
bioteknologi .
Dalam kegiatan rekayasa genetika isolasi
plasmid DNA merupakan salah satu hal yang sangat penting, sebelum bakteri
disisipi oleh plasmid rekombinan yang
telah tersisipi oleh gen maka perlu disisipkan terlebih dahulu plasmid sebagai
vektor, baik sebagai cloning vektor
untuk tujuan perbanyakan copy
dari goi maupun sebagai expression
vektor untuk tujuan ekspresi goi pada sel host.
Plasmid sendiri memiliki pengertian sebagai molekul DNA srikuler berukuran
relatif kjecil dari luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat
didalam plasmid pada umumnya tidak
esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menjadi sintesis protein
untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam kegiatan rekayasa gentika DNA
plasmid seringkali digunakan sebagai
vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang dinginan ke dalam
suatu sel inang. Gen-gen tersebut
selanjutnya akan mengekspresikan produk-produk komersil tertentu seperti inuslin , interferon dan berbagai
enzim
Keberhasilan dalam mempersiapkan plasmid dengan kualitas yang baik sangat diperlukan,
terlebih lagi tingkat kemurnian plasmid apabila akan digunakan untuk squencing
PCR, cloning dan restriction digestion. Oleh karena itu dalam kegiatan pratkum
ini sangat pentig sekali untuk dilakukan, karena dengan melakukan kegiatn
praktikum secara langsung mahasimwa atau praktikan dapat mengertahui secara
langsung dan memiliki pengalaman
serta keahlian dalam menerapkan
ilmu serta mahasiswa dapat memahami
dasar ilmu isolasi DNA plasmid secara
lebih rinci.
1.2
Tujuan
Mengetahui cara isolasi DNA dari Plasmid
Mengetahui cara isolasi DNA dari Plasmid
BAB
2. TINJAUAN PUSTAKA
Setiap sel bakteri
memperoleh suatu plasmid rekombinan yang membawa fragmen DNA asing yang
spesifik, dimana pada percobaan pertama dilakukan oleh Herbert boyer dan
Stanley kohen pada tahun 1973 yang dipotong dengan EcoR1. Plasmid rekombinan
dengan gen tahan sebagai vektor bagi DNA telah banyak digunakan dalam bidang
kesehatan. Penggunaan palasmid-plasmid yang membawa gen resisten terhadap
antibiotik yang telah tersebar luas di alam dengan memutasikan plasmid-plasmid
tersebut sehingga tidak begerak dari suatu sel ke sel yang lain dan dengan
menggunakan strein bakteri yang aman sehingga penggunaan plasmid yang resisten
terhadap obat-obatan dapat digunakan tanpa risikko (Watson et al, 1983).
Isolasi DNA dari gel
dilakukan dengan menggunakan ekstraksi phenol, dimana kemurnian RNA dihitung
melalui perbandingan nilai absorbansi sampel RNA pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm. Kualitas total RNA diuji dengan cara mengelektroforesis pada 1 %
gel agarose. Isolasi RNA dengan menggunakan buffer homogenisasi guanidium
tiosianat merupakan metode yang efisien untuk jaringan yang tidak mudah di
faksinasi dari gel yang kaya akan Rnase. Hasil beberapa penelitian diperoleh
bahwa isolasi RNA dengan metode phenol tidak dadat terdeteksi dalam
elektroforesis gel agarose. Pada penelitian Slameto dan Sugiharato (2010) pada
tanaman tebu dilakukan isolasi dengan cara memmotong DNA dengna enzim restriksi
dalam analisis DNA rekombinan. Plasmid DNA yang mengandung DNA target dipotong
beberapa menggunakan enzim restriksi. Kontaminasi Oleh DNA dihilangkan dengan
melakukan pemberian Dnase sehingga dapat meningkatkan kemurnian RNA dan mampu
mendetanurasi DNA genomik.
Plasmid merupakan DNA
Ekstrakorosomal kecil yang berbentuk sirkuler, yang dapat melakukan replikasi
secara mandiri sehingga tidak bergantung pada replikasi DNA Kromosom. Molekul DNA yang dimiliki oleh plasmid adalah molekul
DNA double stranded yang memiliki panjang basa yang sangat beragam. Plasmid
dimiliki oleh bakteri dan beberapa jenis makhluk hidup eukariotik. Proses
isolasi DNA memiliki perbedaan tergantung pada organisme yang akan diisolasi
DNA nya. Isolasi DNA digunakan untuk memisahkan DNA sehingga DNA dapat
dianalisis. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid
memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu replication
origin, marker yang memungkinkan
adanya seleksi dan
region yang mampu disisipi oleh
fragmen DNA dari luar. Menurut Sumarsih dkk, (2011) Pemotongan ganda DNA
plasmid rekombinan (E1) menggunakan enzim restriksi SacI/ SphI menghasilkan dua
fragmen DNA, yang ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA pada elektroforegram
dengan ukuran sekitar 7000 pb dan sekitar 1500 pb.
Plasmid yang melingkar pada
kromosom ekstra molekul sitoplasma ganda yang meniru secara independen dari
kromosom bakteri. Secara alami plasmid terjadi pada bakteri dan kadang-kadang
ditemukan pada organisme eukariotik. Metode tradisional isolasi plasmid adalah
menggunakan metode lisis alkali dan metode mendidih. Proses ekstraksi
didasarkan pada ukuran, konformasi dan kepadatan plasmid. semua ekstraksi
proses bervariasi adalah lisis sel bakteri, rilis selektif DNA plasmid dari
matriks sel, dan penghapusan kontaminan seperti untuk memulihkan DNA plasmid. Masalah
dalam praktek umum yang sering dikaitkan dengan isolasi plasmid DNA murni
adalah masalah adanya kontaminan oleh senyawa fenolik dan polisakarida karena
mereka menghambat primer klasik PCR dengan menghambat aktivitas polimerase Taq
DNA. Kontaminasi ini mendistorsi hasil di banyak aplikasi analisis dan karena
itu menyebabkan interpretasi yang salah. Konsentrasi DNA dapat ditentukan
dengan cara mengambil absorbansi 620 nm yang dievaluasi melalui larutan gel
agarose 1% (Yadav et al, 2011).
Genomik,
plasmid dan pemurnian produk PCR didasarkan pada pemurnian silika. Terlepas
dari metode yang digunakan untuk membuat lisat dibersihkan, DNA dapat diisolasi
berdasarkan kemampuannya untuk mengikat silika dengan adanya konsentrasi garam
yang tinggi. Garam-garam ini kemudian dihapus dengan mencuci berbasis alkohol
dan DNA dielusi dalam larutan rendah ion-kekuatan seperti TE penyangga atau
air. Pengikatan DNA untuk silika tampaknya didorong oleh dehidrasi dan ikatan
hidrogen formasi, yang bersaing dengan lemah tolakan elektrostatis. Oleh karena
itu, konsentrasi garam yang tinggi akan membantu mendorong adsorpsi DNA ke
silika, dan konsentrasi rendah akan melepaskan DNA. Namun, DNA bukan
satu-satunya molekul yang dapat menyerap sinar UV pada 260 nm. Sejak RNA juga
memiliki absorbansi yang besar pada 260 nm, dan asam amino aromatik hadir dalam
protein menyerap pada 280 nm (Kheyrodin dan Ghasvinian, 2012).
Isolasi
total DNA menggunakan DNA NucleoSpin Tissue Kit yang merupakan kit khusus untuk
bakteri gram negatif dan hasil isolasi total DNA pada beberapa sampel tanaman
wortel terlihat adanya lajur pita DNA pada elektroforesis gel agarosa 1%.
Menurut Ausubel, et al dalam Manalu,
2014), gel agarosa 1% dapat digunakan untuk menganalisis fragmen DNA sebesar
500 pb-10.000 pb. Selanjutnya, menurut Manalu dkk, (2014) Kualitas dan
kuantitas DNA yang bervariasi pada setiap sampel dapat dilihat dari panjang
fragmen DNA atau tebal pita DNA yang dihasilkan. DNA hasil isolasi pada sumur
ke 2 mempunyai ketebalan pita yang paling tebal, dan sumur ke 3 mempunyai
ketebalan pita agak tebal. Hal ini menunjukkan bahwa pada sumur ke 2, hasil
isolasi total DNA nya sangat banyak dan pekat. Sedangkan pada sumur ke 1 tidak
terdapat pita-pita DNA, ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA
tidak terbetuk seperti seharusnya. DNAyang larut akan hilang sehingga perendaman
yang terlalu lama pada buffer TAE dengan alat elektroforesis maka DNA gagal
berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel.
Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk jumlah pasang basa yang berbeda-beda
sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA
tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya.
BAB 3. METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Pratikum mata
kuliah Bioteknologi Pertanian acara “Isolasi DNA plasmid Menggunakan KIT Gene All”
dilaksanakan pada hari Senin
tanggal 27
Oktober 2015 pukul 09.00- selesai di Fakultas
Pertanian, Universitas Jember.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1
Alat
1.
Perangkat
Elektroforesis
2.
Microwave
3.
Micropipete
4.
Enlemeyer
3.2.2
Bahan
1.
Agarose gel 1 %
2.
TBE 1x
3.
Ethium bromide
4.
Buffer loading
3.3 Cara Kerja
1.
Mengambil 1,5 mL
dari kultur bakteri, memasukkan dalam tube, sentrifuse dengan kecepatan 13.000
xg selama 1 menit. Membuang supernatant sehingga hanya tersisa pellet.
2.
Meresuspensi
pellet dalam 170 ul buffer S1 (mengandung RNAse sehingga kondisikan selalu
dingin).
3.
Menambahkan 170
ul buffer S2 dan mix dengan membalikkan tube 3-6 kali (jangan divortex).
Menginkubasi hingga terlihat suspense bakteri tetapi tidak boleh lebih dari 5
menit.
4.
Menambahkan 250
ul buffer G3 kemudian segera mix dengan membalikkab tube 4-5 kali (jangan
divortex).
5.
Memindahkan seluruh
Lysate dari tube ke kolom (yang disediakan oleh KIT
isolasi DNA plasmid), kemudiana disentrifuse selama 30-60 detik. Mengambil
kolom dan membuang cairan yang ada pada tube dibagian bawah kolom, kemudian
meletakkan lagi kolom padatube tersebut.
6.
Optional,
menambahkan 500 ul buffer A W dan sentrifus selama 30 detik. Mengangkat kolom,
membuang cairan yang ada pada tube di bawah kolom, dan meletakkan kembali kolom
pada tube tersebut.
7.
Menambahkan 700
ul buffer PW dan sentrifus selama 30 detik. Mengangkat kolom dan membuang
cairan yang ada pada tube di bagian bawah kolom, kemudian meletakkan lagi kolom
pada tube tersebut.
8.
Mensentrifus
kembali selama 1 menit untuk membuang reside wash buffer. Memindahkan kolom ke 1,5 ml tube (epedorf tube).
9.
Menambahkan 50
ul buffer EB atau deionized distilled water ke tengah kolom, kemudian diamkan
selama 1 menit dan sentrifus selama 1 menit.
BAB
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2
Pembahasan
Konsentrasi DNA dapat
diketahui melalui analisis menggunakan spektrofotometer UV (Ultraviolet) dengan
panjang gelombang 260 nm. Kemurnian DNA dari kontaminan RNA maupun protein
dapat dilihat berdasarkan perbandingan absorbansi suspensi DNA. Adapun rumus
untuk mengetahui konsentrasi DNA yaitu
,
nilai 300 tersebut diperoleh dari tingkat pengenceran yang dilakukan
(1500 ml aquades : 5
. Berdasarkan hasil praktikum
tentang isolasi DNA plasmid diperoleh nilai absorbansi sebesar -0,024 oleh
kelompok 2, nilai absorbansi diperoleh dari sampel yang telah dianalisis menggunakan
spektroforesis UV dengan panjang gelombang 260 nm. Jika diketahui nilai
absorbansi sebesar -0,024, maka diperoleh konsentrasi DNA sebesar -0,36, dengan
perhitungan sebagai berikut.
![](file:///C:\Users\FENDIL~1\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image002.png)
![](file:///C:\Users\FENDIL~1\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image004.png)
![](file:///C:\Users\FENDIL~1\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image007.png)
1000
![](file:///C:\Users\FENDIL~1\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image008.png)
1000
![](file:///C:\Users\FENDIL~1\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image009.png)
1000
= - 0,36
Berdasarkan hasil tersebut dapat dibuktikan bahwa kemurnian
DNA masih belum relatif murni dari kontaminan protein, Manalu dkk (2014), berpendapat bahwa isolat
DNA dapat dikatakan murni dari kontaminan bila nilainya berkisar antara
1,8-2,0. Adapun berdasarkan data golongan konsentrasi DNA tertinggi diperoleh
oleh kelompok 3 dengan nilai absorbansi sebesar 0.045 maka dihasilkan
konsentrasi DNA sebesar 0.675, sedangkan nilai terendah diperoleh oleh kelompok
9 dan 10 dengan niali absorbansi dan konsentrasi DNA sebesar 0. Rendahnya nilai
konsentrasi DNA dapat dipengaruhi oleh besarnya suhu yang terlalu tinggi (99 0C)
saat proses pemecahan dinding sel (lisis), ketika melakukan ekstraksi tidak
dilakukan penambahan buffer, dan penggunaan PBS yang berfungsi untuk
mengisolasi DNA virus mengakibatkan jumlah isolat DNA yang sedikit sehingga
konsentrasi yang diperoleh juga rendah. Perbedaan konsentrasi pada setiap kelompok
(sampel) berbeda-beda hal ini disebabkan oleh perlakuan fisik yang diberikan
serta kemampuan buffer ekstraksi dalam proses lisis (pemecahan dinding sel).
Semakin tinggi ekstraksi lisis sehingga plasmid yang dihasilkan lebih banyak,
diduga saat praktikum isolat DNA plasmid terjadi perbedaan dalam penambahan
konsentrasi.
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diektrasi atau
diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis
DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dengan dari bahan lain
seperti protein, lemak dan kabohidrat.
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran ( lisis) , ektrasi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulose protein, serta
pemurnian DNA ( Dolphin, 2008 ).
Surzycki (2000) melaporkan ada beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam proses isolasi DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA ,
metodenya yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA ,
dan motedenya harus sederhana dan cepat. Prinsip isolasi DNA pada berbagai
jenis atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki
modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Isolasi DNA pada tumbuhan
seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti
KIT Nucleon Phytopure sedangkan untuk kegiatan isolasi yang dilakukan pada
hewan menggunakan Gene JETTM Genomic DNA purifikation Kit. Namun tehapan
–tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memilki protokol sendiri yang
disesuaikan dengan keperluan.
Tahapan –tahapan pertama dalam
isolasi DNA adalah proses perusakan isolasi DNA
atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel atau jaringan
memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan
metode freezing –thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al.,2005) . Adapun tahapn
yang selanjutnya ialah tahapan ektraksi DNA, yang seringkali digunakan
Chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acit ( EDTA) yang memiliki
peran untuk menginaktivasi enzim Dnase yang dapat mendenaturasi DNA yang
diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara megikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai
kofaktor enzim DNAase . DNA yang telah
diekstraksi dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida
dan protin agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ektraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan
protein kehilangan kelarutannya dna
mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui
sentrifugasi.
Setelah proses ekstraksi DNA yang
didapat dipekatkan melalui pertisipasi, pada umumnya digunakan etanol atau
isopropanol dalam tahapan presipitasi.
Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal
membentuk struktur fiber dan terbentuk
struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sntrifugasi .
Presipitasi ini memiliki fungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari
tahapan ektraksi. Adapun prinsip dari persipitasi ini ialah menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar
menggelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air
berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfosiester DNA. Interaksi ini
meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan
dengan air. Pada tahapan ini DNA yang terpresitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa.
Adapun tingkat keberhasilan isolasi plasmit DNA sangat dapat dilihat dari tidak terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforesis, kecuali pada sumur kesatu yang merupakan lamda 10 ng/µl dan sumur kedua yaitu kontrol positif Pgem T-easy yang terbentuk pita-pita DNA hasil isolasi pada sumur gel agarosa. , Ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya (Sambrook & Russel 2001).
Adapun tingkat keberhasilan isolasi plasmit DNA sangat dapat dilihat dari tidak terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforesis, kecuali pada sumur kesatu yang merupakan lamda 10 ng/µl dan sumur kedua yaitu kontrol positif Pgem T-easy yang terbentuk pita-pita DNA hasil isolasi pada sumur gel agarosa. , Ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya (Sambrook & Russel 2001).
![]() |
BAB
5. PENUTUP
5.1
Kesimpulan
Berdasarkan
hasil praktikum Isolasi Plasmid DNA yang dituangkan dalam pembahasan diatas
dapat disimpulkan bahwa. Nilai absorbansi terbesar adalah pada kelompok 3 dengan
nilai sebesar 0.045 dan konsentrasi DNA sebesar 0.675, sedangkan nilai terendah
diperoleh oleh kelompok 9 dan 10 dengan niali absorbansi dan konsentrasi DNA
sebesar 0.
5.2
Saran
Untuk
praktikum kali ini cukup berjalan dengan baik,hanya saja pengerjaan semua
proses praktikumnya praktikan hanya dapat melihat saja. Untuk praktikum
selanjutnya alangkah baiknya jika yang mengerjakan praktikan dipandu dengan
asisten.
DAFTAR PUSTAKA
Dolphin.T 2004. Sejarah dan prinsip-prinsip media konduktif standar
elektroforesis DNA. Anal
Biochem. 333 (1):1-13.
Kheyrodin,
H., K, Ghazivian. 2012. DNA Purification And Isolation Of Genomic DNA From
Bacterial Species By Plasmid Purification System. Agricultural Research, 7(3): 433-442.
Lodish
H et al.Molekular Cell
Biology Fifth Edition. New York : Garland Publishing, Inc
Manalu,
Y, H., I, G, P, Wirawan, I, G, K, Susrama. 2014. Isolasi dan Identifikasi
Agrobacterium tumefaciens dari Tanaman Wortel (Daucus carota L.). Agroteknologi tropika, 3(3): 119-127.
Sambrook & Russel
2001). 2001. Molecular and Cell Biology. New York: Mc Graw-Hill.
Slameto,
B, Sugiharato. 2010. Isolasi cDNA Sucrose Transporter (SUT) dari Batang Tanaman
Tebu (Saccharum officinarum L.). Agrovior,
3(2): 87-94.
Sumarsih,
S., N,N, T, Puspaningsih, A, Soewandi. 2011. Rekombinasi Gen Penyandi
-xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid Phis1525. Jbp, 13(3): 150-154.
Surzycki J, Russel DW . 2000 . Ed. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual 3rdEd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Watson,
J.D. John, T. David. T, K. 1983. DNA
Rekombinan, Suatu Pelajaran Singkat. Terjemahan oleh Dr. Ir. Wisnu Gunarso,
M.Sc. 1988. Jakarta: Erlangga.
Yadav,
P., A, Yadav, V, Garg, T,K, Datta, S, L, Gosmawi, S, De. 2011. A Novel Method
Of Plasmid Isolation Using Laundry Detergent. Experimental biology, 1(49): 558-560.
Zhang,
Y., J, Su, S, Duan, Y, Ao, J, Dai, P, Wang, Y, Li, B, Liu, D, Feng, J, Wang, H,
Wanag. 2011. A highly efficient rice green tissue protoplast system for
transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant methods, 7(30): 1-14.